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癌症研究 中国ALK阳性非小细胞肺癌诊断专家已达成共识

2018-06-30作者:阿甘来源:未知次阅读

  随着分子医学进展和靶向药物的不断涌现,晚期非小细胞肺癌(NSCLC)的治疗已进入到个体化治疗的时代。目前临床应用的个体化靶向治疗主要针对EGFR突变型和ALK融合基因型肺癌,这两种基因变异型肺癌均具有明确的分子靶点、靶点检测技术及上市的靶向药物,临床疗效得到明显提高。其他基因变异型肺癌的靶向药物和伴随分子诊断(companion diagnostics)技术正在快速研发中。肺癌中ALK变异主要为ALK基因发生重排与其他基因融合。其中,EML4-ALK(棘皮动物微管结合蛋白样4-间变性淋巴瘤激酶)融合基因变异是其主要类型,约占所有NSCLC的5%左右[1],[2],[3]。肺癌中与ALK基因融合的其他基因还包括TFG、KIF5B等。
 
  针对ALK靶点的小分子抑制剂克唑替尼(Crizotinib)是一种ATP竞争性酪氨酸激酶抑制剂,可特异性靶向抑制ALK激酶,也可抑制c-MET和ROS1等信号通路。临床试验显示对于ALK阳性的晚期NSCLC患者,克唑替尼的疗效显著优于传统化疗,二线单药治疗患者的中位PFS为7.7个月,有效率达到65.3% [4]。基于其良好的疗效和耐受性,2013年初,中国食品和药品监督管理总局(CFDA)已批准克唑替尼用于治疗ALK融合阳性的局部晚期或转移性NSCLC患者。
  检测基因融合(gene fusion,又称基因重排,gene rearrangement)的方法有多种,包括原位杂交技术、蛋白表达检测技术和PCR检测技术。目前针对ALK融合基因检测常用的方法有三种——荧光原位杂交(FISH)、基于PCR扩增技术(RACE-PCR或RT-PCR联合测序技术、qRT-PCR等)和免疫组织化学法(IHC)。上述三种方法各有其优缺点。FISH虽然是临床试验验证的标准方法,但价格昂贵,操作规范要求较高,且不能区分ALK融合变体(fusion variants)的类型;RT-PCR对标本取材要求较高,需专用的试剂盒进行检测;IHC简便易行,但阳性标准不统一。ALK阳性的NSCLC虽然仅占全部NSCLC的5%,但是每年新发病例数在中国仍接近30,000例 [5]。因此,如何准确诊断ALK阳性的NSCLC便成了临床上的当务之急。2013年3月29日, 中国临床肿瘤学会(Chinese Society of Clinical Oncology, CSCO)肿瘤标志物专家委员会组织相关领域专家在厦门讨论了适合中国实际情况的ALK融合基因检测流程,并就我国ALK阳性非小细胞肺癌的诊断标准达成了专家共识。
 
  一、ALK阳性非小细胞肺癌的定义
 
  专家组共识:ALK阳性非小细胞肺癌是指包括ALK FISH检测、或ALK序列融合变异、或ALK融合蛋白IHC特定方法检测阳性的肺癌,是非小细胞肺癌的一个分子亚型,常见于腺癌,该类患者通常可从ALK抑制剂治疗中获益。
  随着肿瘤分子生物学的进展,临床上对NSCLC的认识正不断深入。2007年Soda[6]和Rikova[7]两个小组分别发现肺癌中存在EML4-ALK融合基因变异现象。2009年Shaw3等将ALK基因重排阳性的肺癌列为非小细胞肺癌的一个特定的分子亚型。根据专家的讨论,从检测方法学角度考虑到ALK融合型肺癌不仅是基因序列层面的改变即序列重排,ALK融合蛋白也是该类疾病中的重要变异,因此将此类疾病统称为ALK阳性非小细胞肺癌。
 
  二、ALK检测适宜人群:ALK阳性肺癌的临床病理特征
 
  专家组共识:晚期非小细胞肺癌患者使用ALK-TKI治疗前必须检测ALK融合变异状态。可优先在病理组织学特点富集的优势患者中进行ALK分子检测,但单纯依靠临床特征与病理分型选择适宜人群并不能完全包括所有的ALK阳性NSCLC患者,对于潜在怀疑存在ALK融合变异的患者均可进行ALK融合基因检测。
 
  研究报道年轻、不吸烟的肺腺癌患者的EML4-ALK融合基因表达率较高3,且在EGFR、KRAS、HER2或TP53等基因未发生突变的NSCLC患者中,ALK融合阳性的比例达25%% [8],我国大陆和台湾地区EGFR、KRAS均为野生型的腺癌中ALK阳性比例高达30%~42% [9],[10]。病理形态学研究提示在含印戒细胞的粘液型或实性腺癌中,ALK的发生率高于其他类型的肺腺癌(46.2% vs 8%) [11]。
  在具有ALK关联的临床病理特征、已明确EGFR/KRAS等分子分析结果的患者中开展ALK检测会提高检出率,有助于临床实际工作的开展。但ALK融合性肺癌并非只存在于肺腺癌、含印戒细胞的肺癌中,研究发现在肺鳞癌、腺鳞癌、EGFR突变型或KRAS突变型肺癌中也可存在ALK融合变异[12]。晚期肺癌患者也可能受到临床取材小样本的局限性,即活检组织标本有时无法保证肺腺癌的准确诊断,因此应考虑对不能判断组织学类型的肺癌(NSCLC NOS)也进行ALK检测。
 
  三、ALK融合基因的检测方法学
 
  专家组共识:ALK FISH、Ventana IHC或基于序列特异性的PCR技术均可作为ALK阳性肺癌的诊断技术,检测实验室应该根据组织标本类型选择合适的检测技术。当怀疑一种技术的可靠性时(如FISH的肿瘤细胞融合率接近15%时),可以考虑采用另一种技术加以验证。
  目前,最常见的ALK基因重排的融合变异为2号染色体短臂倒位突变[inv(2)(p21p23)],形成EML4-ALK融合基因,并编码含EML4的氨基末端和ALK的胞内酪氨酸激酶的融合蛋白生成。ALK融合基因或融合蛋白可在肿瘤组织标本中检测到。目前常用的ALK基因变异或融合蛋白检测方法分为以下三种:荧光原位杂交(FISH)技术、免疫组织化学(IHC)和基于PCR的方法(包括qRT-PCR、RACE-PCR或特异性RT-PCR联合测序技术)。
 
  1、荧光原位杂交(Fluorescent in situ hybridization, FISH)
 
  大部分克唑替尼治疗ALK融合阳性NSCLC的临床试验均是基于FISH的诊断,因此,FISH检测目前仍是诊断ALK融合基因的参照标准方法 [13],[14]。FDA已批准的雅培FISH分离探针试剂盒(Vysis ALK Break Apart FISH Probe Kit)可用于诊断ALK融合基因的表达。该试剂盒设计的两种探针分别标记ALK基因的两端,300 kb的3’端和442 kb的5’端分别标记为橘红色和绿色。在无ALK融合基因表达的肿瘤细胞中,橘红色和绿色重叠为黄色或者相互粘合(两个信号之间的间隔小于两个信号的直径);而在存在ALK融合基因表达的肿瘤细胞中,橘红色和绿色信号相互分离(间隔≥2个信号直径)。标本FISH阳性结果的判定标准为单个视野中的50个肺癌细胞中至少有25个存在分离信号,或者两个不同视野中的100个肺癌细胞中至少有15个存在分离信号。详细的FISH阳性判读标准可参见雅培ALK分离FISH探针试剂盒说明书 [15]。
  ALK FISH技术适用的组织样本类型:10%中性福尔马林固定后石蜡包埋标本(FFPE样本),防脱玻片切片厚度3~5μm。
  原位杂交技术检测ALK变异也存在不足之处。首先,FISH检测对于操作和判读技术要求较高,诊断医师必须经过严格的FISH操作和结果判读培训。只有经FISH操作经验丰富的医师判定的结果才具有可靠性。其次,晚期NSCLC患者通常只能提供2mm左右的小活检组织,很难保证每个视野均存在50个以上的肺癌细胞进行阳性判读。FISH检测结果的判断界值(cut off)也存在商榷之处,研究发现少数ALK FISH阴性、IHC阳性的患者能从靶向药物明显获益[16]。最后,目前FISH检测的成本昂贵,且不能明确ALK融合基因的具体融合变体。因此,虽然FISH检测仍是诊断的重要手段,但现阶段尚无法适用于中国ALK阳性NSCLC患者的大规模筛查和诊断。
 
  2、免疫组织化学法(immunohistochemistry, IHC)
 
  2.1 常规免疫组织化学技术(IHC)
 
  由于FISH检测在中国存在经济适用性和技术操作普及的困难与不足,已有较多学者不断探索其他的分子诊断检测方法。免疫组织化学技术(IHC)因其具有简便易行、价格便宜、操作方法成熟等特点,成为潜在有效的筛查方法。早期的ALK融合蛋白的IHC抗体敏感性较低(ALK1, Dako),因此不适宜用于ALK融合基因的检测[17]。随着技术的改进,新一代具有高度亲和力的D5F3(Cell Signaling, Beverly, Mass)和5A4(Abcam, Boston, Mass)抗体检测ALK 融合蛋白的敏感性和特异性分别达到了100%和95%-99% 17,[18],[19],为其临床应用提供了充分的实验依据。总结已报道的数据后发现(表1),常规(指非自动化仪器辅助的手工操作)IHC检测的强阳性与FISH检测阳性之间存在高度的一致性。IHC 3+到0分的患者FISH阳性率分别为97.4%、62.5%、14.3%和0%。现有数据也证实ALK IHC阳性与克唑替尼临床疗效之间存在相关性[20]。
  采用IHC法需注意以下两点:第一,由于ALK的蛋白表达与神经外胚层的分化有关,故其可能在小细胞肺癌和正常人的脑组织中存在表达[25]。因此,不建议在小细胞肺癌中使用ALK融合蛋白的IHC检测。第二,常规IHC的阳性标准判定尚未统一。推荐常规方法IHC的判读如下:IHC 3+:>5%的肿瘤细胞呈现颗粒状细胞质强着色;IHC 2+:>5%的肿瘤细胞呈现中度细胞质着色;IHC 1+:>5%的肿瘤细胞呈现微弱或模糊的细胞质着色或≤5%的肿瘤细胞有任何程度的着色;IHC 0:肿瘤细胞无着色。
 
  2.2 Ventana IHC
 
  另一种由罗氏公司开发的Ventana ALK融合蛋白IHC诊断试剂盒已经在欧洲获批用于诊断ALK阳性NSCLC。由于其在自动化仪器上操作,可使检测流程和结果判读都得以标准化。该技术平台方法使用了基于非内源性半抗原、信号扩增多聚体和辣根过氧化物酶(HRP)系统的染色信号放大技术。在不影响检测特异性的前提下,大大提高了ALK融合蛋白IHC检测的敏感性。结果判读时采用简单易行的二分类系统,即仅为阳性和阴性两种,阳性结果即可诊断为ALK阳性非小细胞肺癌。数据表明其与FISH结果的吻合率达到98.8%,结果判读的可重复性为99.7% [26],应用前景好,期待其在中国正式获批后可应用于临床诊断。
 
  常规或Ventana IHC技术适用的临床标本类型:10%中性福尔马林固定后石蜡包埋标本(FFPE样本),防脱玻片切片厚度3~5μm。
 
  由于常规IHC存在上述优缺点,考虑到临床实践中的可操作性和患者可接受性,我们推荐在条件缺乏的地区可采用常规IHC法进行ALK阳性NSCLC患者的筛查,且经常规IHC检出为阳性的患者必须接受FISH、序列特异性的PCR技术或Ventana IHC其中任意一种技术的进一步确诊。
 
  3、基于PCR扩增的方法:
 
  3.1 实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(Real-time quantitative reversetranscriptase-polymerase chain reaction, qRT-PCR)
  RT-PCR法检测ALK融合基因的特点在于快速、简便易行、能同时明确ALK已知的融合变体的类型。既往RT-PCR的不足之处在于假阴性率高,这是由于RT-PCR对于RNA的质量要求较高,若结果为阴性,则很难判定是真阴性还是RNA降解所致的假阴性。此外,目前在NSCLC中已陆续发现了20多种不同的ALK融合变体,不能排除仍有未知融合变体的存在。因此,无法检测未知的融合型是其最大的不足之处。这些因素限制了RT-PCR在ALK融合基因诊断中的应用。
 
  国家药品食品管理局(SFDA)已批准的可用于临床的ALK融合基因检测的试剂盒(人类EML4-ALK融合基因检测试剂盒,荧光定量qRT-PCR方法),通过多重引物RT-PCR法,需100-500ng肿瘤组织的RNA,即可检测出EML4-ALK融合基因的阳性信号。该试剂盒可检测7种不同的EML4-ALK融合基因型,基本涵盖了常见的EML4-ALK融合基因型。该方法适用于福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的肿瘤组织样本和各类新鲜组织或细胞学标本。不过,qRT-PCR法也存在着无法检测未知的融合变体和对RNA提取质量要求较高等不足之处,需要临床上提高组织标本的保存质量。
 
  3.2 RACE-PCR联合测序方法
 
  广东省肺癌研究所张绪超等9采用cDNA末端快速扩增PCR(RACE-PCR)联合测序(Sequencing,Seq)技术成功检测分析了ALK基因的融合变异。该方法的独到之处在于采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术结合两轮PCR技术来富集扩增ALK基因的融合变体,敏感性高,不限于检测EML4与ALK的融合,而且可以检测到其它任何基因与ALK的融合,联合PCR产物的直接测序步骤能够明确融合是来自EML4-ALK多种变体中的具体哪一种。这具有一定的临床意义。已知不同EML4-ALK融合基因变体的酪氨酸激酶活性程度有明显差异,因而可能对临床用药剂量有一定的指导价值。该方法主要适用于各类新鲜组织或细胞学标本。
 
  3.3 特异性的RT-PCR联合测序方法
 
  特异性RT-PCR是确认NSCLC存在ALK融合基因的另一种快速诊断方法。技术优势在于其检测突变转录本的高敏感性,如发现扩增产物则意味着ALK融合基因。该技术也存在一些不足。首先,RT-PCR分析必须基于单管多重技术(multiplex),由于EML4-ALK融合基因至少存在11种变体和非EML4的其它融合配对者,所以任何基于PCR的检测策略必须配对所有已知ALK融合基因的明确引物,否则对于潜在的非EML4基因的配对者与ALK基因融合就无法检测出来,而且对于潜在的EML4第21外显子与ALK融合的转录变体长度达1,284bp也可能难于检测。第二,肺癌患者FFPE(formalin-fixed paraffin embedded,福尔马林固定石蜡包埋)组织提取的RNA很容易降解,与新鲜冰冻组织相比,采用RT-PCR操作FFPE标本RNA的难度较大。第三,存在出现非特异性扩增的风险而出现假阳性,需要较高的实验室环境,防止交叉污染出现。在常规临床诊断实验室可能难于开展。
 
  开展基于PCR技术检测ALK融合变异的实验室环境要求应该能够保证检测质量,PCR实验室需要符合我国卫生部(卫计委)临床检测中心的临检PCR室资格认证条件。各检测实验室应做好室内质控,并积极参与外部质控评价项目。考虑到PCR扩增片段的非特异性技术特点,判断基于PCR技术诊断ALK融合变异阳性应该满足以下条件:PCR产物经测序后序列比对确认存在ALK融合序列、或基于融合变异序列特异性荧光探针的实时定量PCR检测结果阳性。单纯RT-PCR产物经电泳后的条带观察不推荐作为ALK融合基因诊断依据。
 
  上述多种技术都可以选择,各有优缺点,存在一定的互补性。结合临床可获得的各类生物材料样本(手术或穿刺活检组织、胸水细胞学和痰液细胞学等),如何有效利用各种检测分析技术获得最高的检出率具有重要的科学意义和临床意义。
 
  四、ALK阳性NSCLC的诊断流程
 
  鉴于ALK基因重排或融合的分子诊断各种方法均有优缺点(表2),且我国适用于ALK变异检测的肺癌患者人数众多,需要在临床建立一套行之有效的分子诊断流程。IHC因其具有方便、易行、价格低的优势,适合于ALK阳性NSCLC的筛查。FISH和逆转录PCR扩增联合测序技术,则由于特异性高和结果判读客观,且qRT-PCR已获SFDA批准用于临床检测,适合于最终的确诊。部分方法的具体操作流程和注意事项可参见SFDA批准的产品说明书或Abott FISH说明书。

 
  * 目前SFDA已批准的qRT-PCR试剂盒可检测至少7种融合型;一般RT-PCR技术可检测少数融合型;RACE-PCR-Seq能检测任何融合型变体。
 
  §基于Ventana自动化平台和试剂盒的IHC采用信号放大技术使得判读较常规IHC更加客观。
 
  专家组推荐ALK检测的总体原则:应综合肺癌获取的各类生物材料的特征、分子检测方法的特点、实验室自身条件,进行多学科大协作,合理采取有效检测方法和流程,以保证ALK融合型肺癌的检出率和准确率。
 
  适合ALK融合基因诊断的肿瘤样本,包括各种组织样本和细胞学标本。组织标本获取手段包括手术切除、支气管镜检、经皮肺穿刺、淋巴结活检、手术活检等。对于恶性胸腔积液、心包积液、痰液或支气管灌洗液、细胞学穿刺和外周血循环肿瘤细胞等样本,在细胞数量充足条件下可制备细胞学样本蜡块(cell block),检测方法可采用FISH或IHC,如果是新鲜细胞标本可考虑采用特异性PCR方法。考虑到细胞学样本的细胞数量少等特点,细胞学标本的检测结果解释需格外谨慎。
 
  综合考虑上述讨论因素:各类检测技术的优缺点、各组织类型的技术适用性特点、ALK融合基因表达的临床病理学富集特点,初步拟出以下用于临床实践的检测流程图(图1)。专家组建议基于我国肺癌患者众多,可考虑非排他性地优先检测部分潜在ALK阳性率较高的病理学特征富集的肺癌患者(如粘液型或含印戒细胞腺癌患者、EGFR基因状态为野生型的腺癌)。对于适合检测的肿瘤标本可直接选择FISH或序列特异性的RT-PCR方法或Ventana IHC进行分子检测诊断。对于EGFR基因状态未知,或EGFR突变患者在EGFR-TKIs治疗后原发或继发耐药的患者,由于存在EGFR和ALK双阳性的可能[28],因此也建议行ALK融合的检测。
 
  四、小结
 
  基于EGFR突变和ALK融合变异等分子标志物的肺癌分子靶向个体化治疗模式已经在临床建立和应用。吉非替尼、厄洛替尼和克唑替尼等EGFR或ALK抑制剂已经应用于临床,在我国正在向更多的肺癌患者推广应用。NSCLC的分子靶向治疗将越来越依赖于分子靶点变异的分子诊断。临床实践中分子检测的标准化和检测流程的建立对于“提高临床实践能力”起关键作用。ALK融合变异作为晚期肺癌中第二个明确应用的分子分型,其诊断方法和流程仍需进一步结合临床数据进行优化。本文根据目前ALK融合基因检测各种方法的优缺点、临床样本的特点和实验室的条件,提出合理的检测流程、推荐应用方法和注意事项。希望各诊疗中心能客观准确地筛查ALK融合变异患者,合理开展基于明确分子诊断的靶向治疗,真正造福广大肺癌患者。
 
  本次“中国ALK阳性非小细胞肺癌诊断的中国专家共识”是在CSCO肿瘤生物标志物专家委员会的倡导下,从临床诊断的角度出发,结合我国肺癌患者众多(约占全球1/3)的现状,综合最新的研究数据和SFDA批准的药物和伴随诊断方法,供临床实践参考。本专家共识将根据实际情况定期更新,期望能为未来进一步优化ALK阳性肺癌患者的诊断和治疗提供指导。

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编辑:阿甘 关键词: ALK肺癌治疗

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